В экспериментальной работе при оценке хромосомных аберраций в клетках человека очень важно правильно их регистрировать и представлять в статьях независимо от точки зрения на механизм их возникновения.
Благодаря такой объективной информации возможность понимания этих механизмов появится быстрее. Это тем более важно, что мы не знаем, одинаковы ли механизмы при разных мутагенных воздействиях.
Количественный учет хромосомных аберраций может проводиться на двух стадиях митоза: метафазе и анафазе.
Учет в метафазе
Распознавание аберраций на этой стадии может осуществляться без кариотипирования клеток и с кариотипированием. Наиболее полный и точный учет аберраций может быть только при кариотипировании клеток. В любом случае надо строго подходить к отбору метафазных пластинок, пригодных для анализа. Хромосомы должны быть равномерно разбросаны, хорошо распластаны, без продольного наложения друг на друга. Для малых хромосом не допускается даже и поперечное наложение.
Аберрации, в определенной мере условно, подразделяют на хромосомные и хроматидные. Условность эта связана с тем, что хроматидные аберрации, пройдя через митоз, преобразуются в хромосомные аберрации.
Под хромосомными аберрациями в узком смысле слова понимают парные аберрации (например, парные ацентрические фрагменты, кольца, дицентрики). Они возникают в тех случаях, когда хромосома повреждена на стадии одной нити.
Хроматидные аберрации (одиночные) — аберрации с вовлечением одной хроматиды поврежденной хромосомы. Изохроматидные аберрации (термин введен для обозначения разрывов обеих хроматид в идентичных локусах) не отличаются морфологически от аберраций хромосомного типа, поэтому употребление этого термина при регистрации аберраций нецелесообразно. Полагают, что аберрации хроматидного типа говорят о повреждении хромосом на постсинтетической или синтетической стадии.
И хромосомные, и хроматидные аберрации могут быть простыми и обменными, захватывающими одну или несколько хромосом. Обмены (или транслокации) между двумя поврежденными хромосомами могут быть симметричными и асимметричными.
Под симметричностью понимают не величину обмениваемых участков, а наличие или отсутствие центромеры в них. Случаи соединения центрических фрагментов одной хромосомы с ацентрическим фрагментом другой хромосомы называют симметричными обменами. Если соединяются центрические фрагменты двух хромосом между собой (или ацентрические фрагменты двух хромосом), то такая транслокация называется асимметричной. Раньше для этих понятий использовали термины эуцентрическая (симметричная) и анэуцентрическая (асимметричная) перестройка.
Аберрации хромосомного типа
1. Парные ацентрические фрагменты обычно не вызывают затруднений в распознавании. Они могут быть от очень маленьких, еле заметных, до очень длинных палочкообразных структур, лежащих как правило параллельно друг другу за счет притяжения сестринских хроматид. Полагают, что они представляют собой концевые делеции. Если пластинка не кариотипируется или в пей не просчитывается число хромосом, то возможна гипердиагностика ацентрических фрагментов. Дело в том, что в клетках человека после обработки колхицином наблюдается асинхронность репликации центромер разных хромосом. Иногда в клетке можно видеть 1—2 и более хромосом, вошедших в анафазу, т. е. с полным отделением двух хроматид. Такие картины могут быть ошибочно приняты за ацентрические фрагменты. Ацентрические фрагменты практически никогда не лежат рядом с фрагментированной хромосомой, так как гипотонизация клеток и последующие процедуры действуют на фрагменты как на самостоятельные единицы. Благодаря этому их легко отличить от изохроматидных пробелов.
2. «Толковые» фрагменты — часто их называют интерстициальными делециями — парные округлые образования без просвета в середине, интенсивно окрашенные, диаметром не менее чем поперечник хроматиды. Считается, что это интерстициальный небольшой участок хромосомы, замкнувшийся в маленькое ацентрическое кольцо. Обе «точки» лежат рядом за счет сестринского притяжения.
3. Ацентрические кольца могут быть легко распознаны при их хорошем распластывании на стекле. Иногда же они располагаются боком. В этих случаях они имеют овальную структуру и без просвета. Оба сестринских кольца лежат рядом, часто с наложением одного на другое (опять же в силу притяжения идентичных участков сестринских хроматид). Ацентрические кольца, как и «толковые» фрагменты, являются участком хромосомы из одного плеча. Таким образом, они относятся к группе перестроек внутри одного плеча хромосомы. Об отличии ацентрических колец от кольцевых хромосом см. ниже.
4. Кольцевые хромосомы (иногда их называют центрическими кольцами) являются замкнутыми структурами, включающими участки большей или меньшей величины из обоих плеч. Они относятся к группе внутрихромосомных перестроек между двумя плечами. При большом количестве повреждений могут образовываться кольцевые хромосомы из двух хромосом, т. е. быть дицентрическими. По сути дела это комплексная аберрация. Основной вопрос, который возникает при виде кольцевой структуры, — имеется или не имеется в ней центромера. При наличии центромеры два сестринских кольца бывают сдвинуты по отношению друг к другу, будучи фиксированы в одной точке (центромере), чего не наблюдается у ацентрических колец.
Часто центромера в кольцевой хромосоме морфологически легко распознаваема, как и в нормальных хромосомах.
5. Хромосомы, имеющие более чем одну центромеру (дицентрические, трицентрические и т. д.), распознаются даже без кариотипического анализа почти в 100% случаев. При кариотипировании можно определить, какие хромосомы вовлечены в дицентрик. Иногда продольное наложение одной хромосомы на другую или их соприкосновение концами может выглядеть подобно дицентрику. Это, как правило, легко различимые и редко встречаемые случаи.
Дицентрики и трицентрики (и т. п.) являются межхромосомными асимметричными транслокациями. При большом количествѳ повреждений на клетку могут встречаться дицентрики с «вставками» из других хромосом. Такой дицентрик эквивалентен по характеру перестройки (по количеству разрывов) трицентрику.
6. Ненормальные для данного кариотипа хромосомы (по длине или соотношению плеч) могут быть следствием перицентрической инверсии или симметричной межхромосомной транслокации в случае* обмена кусками неравной длины или делеции.
Такие аберрации распознаются главным образом только при кариотипическом анализе. При перицентрической инверсии хромосома остается той же ддины, а меняется только соотношение плеч. Сходная картина, не отличимая от перицентрической инверсии, может быть при транслокации участка с одного плеча в другой (той же хромосомы). Однако для этого необходимо не менее трех разрывов в одной хромосоме, что встречается крайне редко. При симметричной транслокации измененными будут 2 хромосомы (по одному плечу у каждой). При этом в одной хромосоме будет избыток материала,, а в другой — недостаток такой же величины. Если увеличение длины одного плеча не равно укорочению длины другого плеча, то следует думать о более сложной перестройке с вовлечением нескольких хромосом.
Делегированная хромосома распознается легко по укорочению одного из; плеч. Если наблюдение относится не к первому митозу, то ацентрических фрагментов в клетке может не быть.
Аберрации хроматидного типа
Как и в случае аберраций хромосомного типа, имеется две группы аберраций хроматидного типа: фрагменты и обмены.
1. Фрагменты (одиночные, или хроматидные, как их иногда называют) могут лежать рядом с хромосомой или отдельно. Хроматидные фрагменты приходится довольно часто дифференцировать от ахроматических пробелов. Абсолютных критериев для отличия пока не имеется. Однако, согласно наиболее строгим критериям, в трех ситуациях говорят о фрагментах: когда фрагмент перевернут, сдвинут по оси, сдвинут по длине. Величина неокрашиваемого участка не может рассматриваться как показатель истинного разрыва.
Изохроматидные фрагменты со слиянием сестринских хроматид имеют вид дуги.
2. Обмены хроматидного происхождения крайне многообразны. Они могут быть хроматидами одной хромосомы (одного плеча или разных) или нескольких. Схемы различных вариантов обменов в хроматидах можно найти в литературе (Д. Ли, X. Ивенс), поэтому они здесь не приводятся. При межхроматидных обменах фигуры могут быть в форме три-, квадри- и мультирадиалов.
В клетках человека наиболее частыми формами обменов являются обмены между хроматидами двух хромосом, относящиеся к группе квадрирадиалов. При анализе каждого обмена наиболее полная информация будет при ответе на следующие вопросы:
1) симметричность транслокации (эу-или анэуцентричность),
2) реципрокность при симметричных обменах или полнота при асимметричных;
3) гомологичность вовлеченных хромосом и их идентификация;
4) сравнительная величина участков (равные — неравные) при транслокации между гомологичными хромосомами.
Учет в анафазе
При учете аберраций на стадиях анафазы и ранней телофазы (ранняя анафаза и поздняя телофаза не пригодны для количественного учета аберраций) в клетках человека мы можем различать только ацентрические фрагменты, кольца и мосты, т. е. значительно меньше типов аберраций, чем на стадии метафазы.
1. Фрагменты и кольца (ацентрические) могут быть одиночными и парными. Они могут располагаться в промежутке между полюсами или в стороне. Их необходимо дифференцировать от отставших хромосом.
2. Мосты могут быть хромосомные и хроматидные. Хромосомный мост представляет собой дицентрическую хромосому и поэтому он состоит из двух хроматид, чаще всего перекрещенных. Хроматидный мост — дицентрическая хроматида, поэтому он виден в виде одиночного тяжа. «Толщина» моста не говорит о его хромосомном или хроматидном характере. Когда в клетке встречаются несколько мостов, необходимо решать относительно каждого, хромосомный он или хроматидный.
Наряду с истинными анафазными мостами (дицентриками) могут образовываться мосты за счет слипания хромосом. Для последних характерно, что в месте слипания хромосомы часто образуют тупой угол и что в месте слипания (как правило, в середине моста) имеется утолщение,, диаметр которого варьирует в зависимости от величины слипшихся участков.
Сочетаемость аберраций в клетке
В клетке может встречаться одна или несколько аберраций. Вместе с дицентрической или кольцевой хромосомой в первом после облучения митозе будут встречаться ацентрические фрагменты. В клетках человека, облученных in vivo и in vitro, наблюдается почти всегда явление полного асимметричного обмена, т. е. дицентрическая или кольцевая хромосома сопровождается только одной парой ацентрических фрагментов. Если в клетке имеется более одной пары ацентрических фрагментов на дицентрик, то все фрагменты сверх одной пары надо рассматривать как самостоятельные (независимые от асимметричного обмена) концевые делеции.
Наличие дицентрической хромосомы без ацентрических фрагментов в» большинстве случаев говорит о том, что это не первый митоз после повреждения. Вероятность потери ацентрических фрагментов при приготовлении препаратов такова же, как и любой другой структуры из этой метафазной пластинки, т. е. очень невелика.
Если в клетке имеется две пары идентичных фрагментов или колец, это означает, что клетка находится во втором после повреждения митозе.
Возможны и некоторые другие сочетания аберраций, по которым можно судить о сроках и характере повреждения. Поэтому необходимо тщательно регистрировать хромосомные аберрации.
Регистрация аберраций в первичных протоколах должна быть наиболее полной. Для этого лучше использовать регистрацию аберрантных іметафаз в виде рисунка-схемы, а не подсчет только отдельных типов аберраций.
При представлении данных в статье или докладе желательно сообщать:
1) число обследованных лиц;
2) число изученных метафаз;
3) число и типы аберраций хромосом;
4) число метафаз с аберрантными хромосомами. Все эти вопросы, кроме первого, могут быть отражены в одной таблице метафаз с аберрантными хромосомами.
Определенной схемы в регистрации и представлении данных для всех случаев не может быть. Это зависит от цели исследования и объекта. Иногда бывает достаточно указать число аберрантных клеток и число аберраций, подразделив последние на хроматидные и хромосомные. Однако следует стремиться к наиболее полному представлению экспериментальных данных так, чтобы они могли быть использованы другими исследователями для проверки гипотез или обобщения материала.