Наиболее подходящей стадией клеточного цикла для тонкого исследования хромосом является метафаза митоза. Именно в этой стадии хромосомы приобретают особенности морфологии, допускающие их более или менее точную идентификацию.

Прямые методы исследования метафаз применяются лишь в том случае, когда доступен источник ткани, обладающей достаточной митотической активностью. У человека такой тканью являются костный мозг и лимфатические узлы. Во время эмбрионального развития также отмечается высокая митотическая активность, и эмбриональный материал тоже пригоден для исследования хромосом в метафазе прямыми методами. Прямые методы исследования хромосом в метафазе также широко применяются при цитогенетическом исследовании новообразований.

Преимущества прямого метода в таких случаях связаны с тем, что при этом методе изучаются метафазные хромосомы в тех клетках, которые начали свое развитие еще в организме. При исследовании опухолей это особенно важно, так как опухолевые элементы с трудом размножаются в культуре.

Недостатком прямого метода является то обстоятельство, что не всегда митотический индекс в данной ткани таков, что позволяет получить достаточное количество метафаз для анализа. Чтобы обойти это затруднение, прибегают к предварительной инкубации клеток, извлеченных из организма, в течение 2—3 часов с колхицином. Алкалоид колхицин блокирует образование митотического веретена и тем самым задерживает митоз в стадии метафазы.

Общая схема различных методик, используемых для получения препаратов метафазных хромосом, сводится к ряду последовательных процедур, направленных на то, чтобы отделить клетки взятого образца друг от друга и добиться хорошего «разброса» хромосом на стекле. Эти процедуры варьируют в отдельных деталях в зависимости от свойств ткани, взятой для анализа, и в зависимости от того, каким методом лучше владеет данный исследователь. Ниже мы описываем наиболее общепринятые методы приготовления препаратов метафазных хромосом без использования предварительного культивирования.

а) Костный мозг

Взятие материала. При помощи стерильной пункции берут от 0,25 до 1 мл костного мозга. Пунктат помещают в 20 мл раствора «6—7» (0,6% раствор глюкозы в 0,7% растворе хлористого натрия). В этом растворе костный мозг можно перевозить и хранить 1—2 часа.

Обработка клеток. Все 20 мл раствора со взвесью клеток разводят в 4 раза 0,44% раствором трехзамещенного цитрата натрия и оставляют при комнатной температуре на 20—30 минут. Это обработка гипотоническим раствором. После гипотонической обработки клетки осаждают на центрифуге при 800—1000 об/мин (центрифуга ЦЛК-1) в течение 5 минут. Фиксация: к осадку прибавляют 5 мл 50% уксусной кислоты и держат в ней клетки в течение часа. Затем заменяют кислоту на 2% раствор уксуснокислого ацет-орсеина.

Приготовление препарата. На чистое сухое предметное стекло помещают каплю суспензии клеток в ацет-орсеине, накрывают каплю покровным стеклом и раздавливают клетки, производя давление на покровное стекло в строго вертикальном направлении. Заливают края стекла парафином для того, чтобы краска не высыхала. Исследуют препарат под микроскопом.

Эта оригинальная методика Сандберга впоследствии претерпела ряд изменений. Ряд исследователей стали использовать предложенный еще в 1958 г. Ford метод предварительной инкубации суспензии клеток костного мозга с колхицином или с колцемидом (синтетический аналог колхицина).

Bottura и Ferrari (1960) предложили вводить колхицин пациентам парентерально, однако этот метод не был принят большинством исследователей, так как было показано, что парентеральное введение колхицина даже в малых дозах небезопасно (Stewart, 1960).

Затем оказалось, что методика раздавливания приводит ко многим артефактам и технически сложнее, чем предложенный в 1958 г. Rothefels и Siminovitch метод приготовления препаратов хромосом при помощи высушивания на воздухе.

В лаборатории цитогенетики человека Института морфологии человека АМН СССР принята следующая методика приготовления препаратов хромосом из клеток костного мозга.

Стернальный пунктат в количестве 0,25—1 мл помещают в раствор Хенкса или среду 199, подогретую до 37°. В раствор Хенкса или среду 199 вводят колхицин до конечной концентрации 0,5 у/мл. В этой среде с колхицином клетки инкубируются 2—2 ¹/₂ часа, после чего осаждаются на центрифуге при 800—900 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют гипотонический раствор (0,95%) трехзамещенного цитрата натрия. Клетки инкубируются в этом растворе в течение 20—40 минут при температуре 37°. По окончании инкубации суспензия клеток снова осаждается на центрифуге при тех же режимах, и к осадку осторожно, по стенке пробирки, чтобы не разбить осадок, добавляют фиксатор. Осадок выдерживается в фиксаторе в течение 30 минут, после чего клетки ресуспендируются легким встряхиванием или при помощи пастеровской пипетки. Клетки несколько раз (2—3) отмывают в фиксаторе и окончательно ресуспендируют в небольшом его количестве (количество фиксатора зависит от концентрации клеточной суспензии). Каплю клеточной суспензии в фиксаторе помещают на чистое сухое стекло и поджигают. Фиксатор выгорает, а клетки прочно фиксируются к стеклу. Затем препарат окрашивают и исследуют под микроскопом.

Эмбриональный материал

Как правило, хромосомы в эмбриональном материале исследуются в клетках, введенных в культуру. Однако если нет условий для культивирования тканей и есть свежий материал, то можно получать хорошие препараты непосредственно из эмбриональной ткани. Полученный материал сразу же измельчают острыми ножницами. Измельченные фрагменты энергично «пипетируются» непосредственно в центрифужной пробирке. Крупные кусочки можно отбросить, а жидкость, помутневшую после «пипетирования», центрифугируют для осаждения клеток. Клетки затем обрабатывают так же, как клетки костного мозга. Эмбрионы длиной 2—6 см легко подвергаются механической дезагрегации. У более крупных плодов можно извлекать паренхиматозные органы— головной мозг, селезенку, тимус, печень. Н. П. Бочков (1962) предложил кратковременное культивирование (около 24 часов) небольших кусочков эмбриональной ткани с последующей обработкой гипотоническим раствором и раздавливанием.

б)    Исследование хромосом в опухолях

При исследовании хромосом в новообразованиях встречается ряд трудностей. При введении опухоли в культуру нет никакой уверенности в том, что размножаются именно злокачественно трансформированные клетки, а не элементы стромы. Поэтому большинство исследователей предпочитает работать с асцитными опухолями, так как солидные раки и скирры трудно подвергнуть цитологической обработке из-за их плотности. Легче обстоит дело с опухолями «мозговой» консистенции и при исследовании экссудатов. Makino предлагает метод получения препаратов хромосом из клеток опухолей, включающий измельчение фрагмента опухоли, инкубацию кашицы в дестиллированной воде. Последующая обработка ведется так же, как и любой клеточной суспензии. В ряде случаев после гипотонической обработки применяется мацерация в 30% уксусной кислоте. Время мацерации подбирается эмпирически.

в)    Исследование хромосом в стадии поздней анафазы и ранней телофазы

Если исследование хромосом в стадии метафазы применяется в тех случаях, когда требуется дать характеристику кариотипа в целом и отдельных хромосом, а также если нужно подсчитать хромосомы, или обнаружить качественные, структурные изменения отдельных хромосом, то исследование хромосом в поздней анафазе и ранней телофазе позволяет получить количественные данные относительно хромосомных перестроек. Для того чтобы получить четкие картины анафаз и телофаз, нет необходимости прибегать к таким специальным процедурам, как обработка колхицином и гипотоническим раствором. Анализ анафаз-телофаз при некотором навыке можно вести достаточно быстро. При таком анализе о хромосомных перестройках судят по наличию мостов и фрагментов. В предыдущих главах уже разбирался вопрос о механизме возникновения этих явлений. Анализ на анафазах и телофазах применяется в тех случаях, когда нужно оценить мутационный процесс (как естественный, так и индуцированный). Методы приготовления препаратов для такого анализа просты: можно использовать как обычную гистологическую технику окрашенных срезов, так и традиционную технику цитогенетиков — приготовления тотального препарата путем раздавливания в ацет-орсеине. Следует отметить, что, как и для всех прямых методов, большое значение имеет свежесть материала, так как митозы быстро проходят после извлечения тканевого фрагмента из организма. А. А. Прокофьева-Бельговская и И. В. Вешнева, используя метод раздавливания в ацет-орсеине при исследовании эмбрионального материала, сравнили частоту хромосомных повреждений в фибробластах человека in vivo и in vitro.

Практически приготовление препарата для исследования анафаз и телофаз сводится к фиксации фрагментов в фиксаторе Карнуа и к раздавливанию их после предварительной окраски ацет-орсеином по способу, приведенному выше. Еще раз подчеркиваем, что материал должен быть совершенно свежим, т. е. приготовление препарата, во всяком случае фиксацию материала, нужно производить сразу же после получения образца ткани.