Эмбрионы человека представляют собой уникальный материал, имеющий огромную ценность для исследователей любой специальности, занятых изучением проблем биологии человека.

Эмбрионы и плоды сроком до 28 недель являются объектом, доступным для любых экспериментов. Однако до самого последнего времени этот ценнейший материал не подвергался комплексному и направленному исследованию. Уже давно в практику медицины вошел обязательный патогистологический анализ любых тканей и органов, удаленных оперативным путем. Эти исследования позволили установить этиологию и патогенез огромного числа заболеваний человека и найти правильные методы их лечения. По инерции и до настоящего времени подробно исследуются тысячи удаленных червеобразных отростков и миндалин, хотя далеко не всегда это вызвано необходимостью, и совершенно никак не обследуются тысячи человеческих эмбрионов, удаляемых во время спонтанных и медицинских абортов. Между тем даже простое, но тщательное описание эмбрионов, накапливаемое в течение многих лет, сейчас позволило бы выяснить многие вопросы эмбриогенеза человека и, в частности, этиологию спонтанных абортов, от которых гибнет до 15% всех зигот.

Разработанные в последние годы методы цитогенетического исследования человеческих эмбрионов создают предпосылки для их комплексного исследования, результатом которого будет установление связи между изменениями в хромосомном наборе и нарушениями эмбриогенеза.

Наиболее рациональным подходом к этой проблеме является одновременное комплексное изучение эмбрионов человека, включающее эмбриоморфологические, биохимические, вирусологические, иммунологические и цитогенетические методы исследования. Однако цитогенетическое исследование и само по себе чрезвычайно богато научной информацией:   оно, во-первых, позволяет установить спектр хромосомных аберраций у человека, поскольку основная масса аберрантных эмбрионов погибает в ранних стадиях эмбриогенеза; во-вторых, проясняет вопрос о причинах возникновения хромосомных аберраций и тем самым позволяет подойти к их профилактике. Создание музея аберрантных культур позволит в дальнейшем установить некоторые биохимические механизмы действия хромосомных геномных мутаций.

Цитогенетическое исследование эмбрионов человека состоит из нескольких этапов:

1) сбор и хранение материала,

2) предварительное исследование материала,

3) введение материала в культуру,

4) приготовление препаратов,

5) анализ и обработка данных.

а) Сбор и хранение материала

Цитогенетическое исследование эмбрионов человека весьма трудоемко, поэтому усилиями одного исследователя может быть охвачен очень небольшой материал. Так, с 1961 по 1966 г. во всем мире было цитогенетически исследовано всего около 800 эмбрионов, полученных в результате спонтанных абортов, и около 450 — от медицинских. Необходимость суммирования результатов, полученных разными авторами, требует стандартизации методов исследования.

Материал для исследования может быть получен из абортариев родильных домов или из гинекологических больниц, где концентрируются пациентки с начавшимся самопроизвольным выкидышем. В первом случае могут быть получены эмбрионы и плоды в возрасте от 6 до 12 недель, во втором — от 6 до 28 недель.

В каждом случае необходимо тщательно собирать следующие паспортные и анамнестические данные:

1)    дата аборта;

2)    имя и фамилия матери (желательно выяснить девичью фамилию матери для установления возможного кровного родства между родителями);

3)    год рождения и адрес матери. Профессия и род деятельности;

4)    фамилия и имя, год рождения и занятие отца;

5)    этническая группа или национальность матери и отца;

6)    дата начала последней менструации;

7)    число предшествовавших беременностей и их результаты: живорождения, мертворождения, спонтанный аборт, медицинский аборт, многоплодие;

8)    группа крови матери;

9)    наличие вредных воздействий в течение последней беременности или незадолго до ее наступления (ионизирующая радиация, лекарственные препараты, в частности цитостатики и контрацептики, вирусные инфекции, травмы, лихорадочные заболевания).

Плодное яйцо или его элементы следует немедленно и по возможности стерильно поместить в раствор Хенкса или физиологический раствор, содержащий пенициллин и стрептомицин в концентрации 500—1000 ЕД/мл. Материал может храниться до введения в культуру в холодильнике при + 4° до 3 суток. При этом следует помнить, что чем раньше материал введен в культуру, тем лучше рост клеток.

б) Предварительное исследование материала

Оно включает внешний осмотр, описание или зарисовку и фотографирование эмбриона или плода. При внешнем осмотре следует обращать внимание на степень мацерации тканей и наличие выраженных аномалий развития. Должны быть измерены затылочно-копчиковый и затылочно-пяточный размеры плода, желательно взвесить плод целиком и отдельно его органы. Измерения и взвешивание плода необходимы для установления его возраста. К сожалению, точные способы определения возраста плода и эмбриона до настоящего времени еще не разработаны, поэтому приходится использовать имеющиеся данные. Все описанные процедуры должны производиться в боксе в стерильных условиях.

От каждого эмбриона до введения в культуру следует взять небольшие участки разных тканей для гистологического исследования (фиксация 10% раствором нейтрального формалина) и для определения полового хроматина (фиксация раствором Карнуа). В тех случаях, когда условия позволяют, эмбриональный материал немедленно после его извлечения может быть подвергнут цитогенетическому исследованию без культивирования методом давленых препаратов. Если плод целый и достаточно крупный, следует определить групповую принадлежность его крови. Кровь насасывают пастеровской пипеткой из сосудов пуповины или из сердца.

в) Введение материала в культуру и культивирование

Каждый эмбрион или плод требует индивидуального подхода к культивированию в зависимости от его биологической сохранности, размеров и целей исследования.

При цитогенетическом исследовании материала спонтанных абортов нужно изучать кариотип как самого плода, так и его зародышевых оболочек. В значительном проценте случаев при так называемой неразвивающейся беременности элементы плода полностью отсутствуют и плодное яйцо представляет собой пустой зародышевый мешок. Как показали проведенные исследования, именно эти случаи чаще всего сопровождаются аномалией кариотипа (тетраплоидия, триплоидия, трисомии).

Естественно, что в подобных случаях приходится исследовать только плодные оболочки.

Культивирование тканей плода

В целях изучения генетического контроля над морфогенезом целесообразно исследовать кариотип в различных тканях и органах плода, особенно при выраженных аномалиях их.

Практически любая эмбриональная ткань пригодна для культивирования и цитогенетического изучения. Однако в ряде случаев без специального цитохимического исследования трудно решить, размножаются ли в культуре специфические элементы данного органа или клетки стромы.

Чаще всего при цитогенетическом изучении эмбрионов используется культура фибробластов, для чего разработаны основные методики.

г) Методы дезагрегации тканей

Наиболее удобна для цитогенетического исследования однослойная культура клеток. С целью получения однослойного роста необходима клеточная суспензия. Это достигается механической или ферментативной дезагрегацией тканей.

Механическая дезагрегация производится путем тщательного измельчения ткани ножницами и последующим пипетированием в небольшом количестве питательной среды. При этом образуется суспензия из клеток и небольших кусочков ткани. Такая дезагрегация применяется при культивировании эмбрионов раннего возраста, паренхиматозных органов и мацерированных плодов. После пипетирования суспензию разводят до нужной концентрации питательной средой и разливают по культуральным сосудам. При таком способе дезинтеграции хороший рост получается при культивировании как отдельных клеток, так и небольших фрагментов ткани.

При ферментативной дезагрегации предварительно измельченную ткань заливают подогретым до 37° раствором 0,02% версена и 0,25% раствором трипсина в отношении 1:3. В этой смеси тканевая кашица инкубируется 5—10 минут, после чего смесь трипсина и версена осторожно сливают и наливают небольшое количество подогретой среды. Производят тщательное пипетирование ткани, размягченной ферментативной обработкой. Помутневшую жидкость собирают в чистую стерильную посуду. К оставшимся комочкам снова добавляют смесь версена с трипсином и повторяют указанную процедуру несколько раз. При этом способе дезагрегации получается небольшой выход клеток, и применять его следует лишь в том случае, когда имеют дело с эмбрионами раннего возраста, у которых наиболее нежные ткани. Небольшое количество трипсина и версена, попадающее в питательную среду, не мешает культивированию, так как инактивируется сывороткой.

Наиболее употребительным способом ферментативной дезагрегации является метод Далбекко и Фогта, применяемый с небольшими модификациями во многих лабораториях. При этом методе тканевая кашица в растворе версена и трипсина разбивается на клетки с помощью магнитной мешалки. Каждые 10 минут трипсинизации после оседания крупных фрагментов помутневшую жидкость сливают в стерильные центрифужные стаканы, снабженные крышками, и центрифугируют 5 минут при 2000 об/мин. Осадок ресуспендируют в питательной среде. Эта процедура может быть повторена многократно в зависимости от требуемой концентрации клеток. Следует отметить, что по мере трипсинизации можно уменьшать количество трипсина и увеличивать количество версена, который в меньшей степени повреждает клетки.

После получения концентрированной суспензии производят подсчет клеток в камере Горяева по общепринятому способу и суспензию разводят питательной средой до нужной концентрации клеток. Концентрация клеток должна быть различной в зависимости от вида ткани, из которой получены клетки. Общее правило заключается в том, что чем менее жизнеспособна ткань, вводимая в культуру, тем большей должна быть концентрация клеток. Так, клетки, полученные от мацерированного эмбриона, следует вводить в культуру в концентрации до 1X 10⁶ клеток на 1 мл питательной среды, в то время как клетки свежего эмбриона раннего возраста лучше засевать в концентрации 2Х 10⁵ клеток на 1 мл.

В некоторых случаях, когда материала для культивирования очень мало, целесообразнее использовать плазменные культуры маленьких кусочков. Классический метод плазменных культур состоит в том, что небольшой фрагмент ткани помещают в каплю гепаринизированной куриной плазмы, к которой прибавляют каплю куриного эмбрионального экстракта. Однако как получение куриной плазмы, так и приготовление куриного эмбрионального экстракта отнимают много времени и не всегда возможны. Мы применяем следующий метод плазменных культур. К 1 мл человеческой сыворотки AB (IV) добавляют на глаз небольшое количество (на кончике стерильного скальпеля) сухой человеческой плазмы. На дно флаконов Карреля наносят 2—3 капли такой смеси и в них помещают маленькие (2—3 мм²) кусочки культивируемой ткани. Флаконы оставляют на несколько часов или на ночь в термостате. После того как кусочки прочно прилипнут ко дну, осторожно наливают питательную среду в количестве, достаточном, чтобы покрыть кусочки. Спустя 5—6 дней культуры просматривают при малом увеличении микроскопа и отмечают наличие характерного выроста вокруг кусочков. Когда мигрирующие из кусочка клетки образуют плотный слой, сливают среду, добавляют к культуре 1—2 мл трипсина, инкубируют в течение 20 минут в термостате и смывают клетки теплой средой. После подсчета клеток доводят суспензию до нужной концентрации и разливают в культуральные сосуды.