Культура лейкоцитов периферической крови здоровых людей и больных лейкозом использовалась для исследования хромосом еще в 30-х годах (Хрущов). Однако этот метод нашел широкое применение лишь после обнаружения цитогенетических свойств белково-полисахаридного комплекса из семян фасоли, ранее использовавшегося для неспецифической агглютинации эритроцитов. Применение этого препарата (фитогемагглютинина) вместе с гипотоническим раствором позволило значительно упростить и ускорить методики получения большого количества делящихся клеток. Метод детально был разработан группой исследователей во главе с Moorhead, и в различных модификациях является общепринятым. Основа метода состоит в том, что плазму с лейкоцитами смешивают в определенной пропорции с питательной средой, к ней добавляют фитогемагглютинин и культуру разливают в стерильные сосуды для культивирования. Модификации, предложенные разными авторами, касаются преимущественно методов получения суспензии лейкоцитов в плазме, методов обогащения этой суспензии лимфоцитами, а также количеств крови, используемой для культивирования. По мере того как различные исследователи применяли этот метод, было обнаружено, что не только фитогемагглютинин способен стимулировать митозы в культуре лимфоцитов. Подобные свойства присущи туберкулину при культивировании лимфоцитов лиц, дающих положительную реакцию на туберкулин.

Свойствами стимулировать митозы обладают также бактериальные полисахариды и дрожжевой экстракт. Было обнаружено, что лимфоциты, полученные от разных людей, при совместном культивировании стимулируют друг друга к размножению.

Подобными же свойствами обладает экстракт из чужеродных лимфоцитов. Лишь лимфоциты однояйцевых близнецов не обнаруживают таких свойств, на основании чего предлагается использовать этот «лимфоцитарный тест» для диагностики зиготности. У некоторых лиц часть лимфоцитов способна размножаться в культуре и без фитогемагглютинина. Особенно часто это наблюдается у лиц, страдающих аутоиммунными заболеваниями, в частности сенной лихорадкой. Все эти факты свидетельствуют о том, что в основе митогенетического действия фитогемагглютинина и других агентов лежат иммунологические механизмы. После воздействия фитогемагглютинином лимфоциты, которые находятся в стадии глубокой интерфазы, точнее периода G₁ (что касается дифференцированных клеток, то предпочитают говорить о стадии G₀), претерпевают так называемую бластную трансформацию, приближаясь по морфологическим и цитохимическим свойствам к лимфобластам. В целом ряде работ показано, что подобную трансформацию претерпевают преимущественно малые лимфоциты, в меньшей степени моноциты. Остальные формы лейкоцитов постепенно исчезают из культуры. Поскольку основная масса клеток в культуре крови «стартует» из одной стадии митотического цикла, постольку в митоз большинство клеток вступает более или менее синхронно, волнами. Первые митозы появляются в культуре лимфоцитов спустя 24 часа, однако их слишком мало.

Следующая волна митозов наблюдается на 48-м часу культивирования, и больше всего делящихся клеток бывает, как правило, на 72-м часу после введения в культуру. Однако достаточно много клеток делится и на 96-м часу культивирования. В зависимости от количества крови, взятой для исследования, различают обычный или макрометод, полумикрометод и микрометод.

Культивирование лимфоцитов периферической крови по классическому способу Мурхеда (Moorhead и др., 1960).

1.    Заготавливают стерильные пробирки, содержащие 1 мл раствора гепарина. Гепарин применяется в виде патентованного раствора, разбавленного в 20 раз физиологическим раствором. Пробирку закрывают стерильной пенициллиновой пробкой, которую сверху заклеивают лейкопластырем.

2.    Набирают в стерильный шприц из пробирки немного гепарина и смачивают стенки шприца и иглу для венепункции. Одну иглу оставляют в пробирке.

3.    Набирают 10 мл крови из локтевой вены и вводят кровь в пробирку с гепарином, проколов пенициллиновую пробку иглой.

4.    Ставят кровь в вертикальном положении в холодильник при +4° на 30 минут. Если за это время эритроциты не осели, в стерильных условиях добавляют 10% раствор желатины из расчета 1 мл на 10 мл крови.

5.    После того как эритроциты осядут, мерной пипеткой отсасывают плазму.

6.    Смешивают плазму с питательной средой (среда № 199 или среда Игла) в соотношении 1 часть плазмы : 1 ¹/₂ части среды.

7.    На 10 мл смеси вносят 0,2 мл фитогемагглютинина фирмы Wellcome или Difco М или 0,02 мл Difco Р. Добавляют антибиотики (пенициллин из расчета 100 единиц на 1 мл).

8.    Разливают культуру по пенициллиновым флаконам: по 1,5 мл на флакон. При розливе продувают культуру альвеолярным воздухом, чтобы насытить среду нужным количеством углекислоты. Ставят культуру в термостат.

9.    На 68—69-м часу культивирования вводят колхицин в каждый флакон из расчета 0,5 мкг на 1 мл питательной среды. Практически удобнее использовать раствор колхицина на физиологическом растворе, содержащем 10 мкг вещества на 1 мл.

Такого раствора нужно взять 0,075 мл, чтобы при добавлении к 1,5 мл получить конечную концентрацию 0,5 мкг.

10.    После 3—5 часов инкубации с колхицином культуру сливают в центрифужные пробирки и приступают к дальнейшей обработке.

В ряде случаев можно обойтись без введения желатины, если РОЭ достаточно быстрая и эритроциты оседают при стоянии крови в холодильнике. Не обязательно разливать культуру по пенициллиновым флаконам — можно приготовить культуру в матрасе и в нем же культивировать. Однако при культивировании во флаконах можно фиксировать не всю культуру сразу, а по порциям, в течение нескольких дней. Часть плазмы можно не вводить в культуру, а сохранить в холодильнике и снова ввести в культуру спустя 3—4 дня, если первая культура была неудачной.

Пѳлумикрометод. Полумикрометод применяется тогда, когда приходится использовать небольшие количества плазмы. Это бывает в том случае, если по каким-либо причинам нельзя получить много крови, или когда нужно разделить плазму от одного индивидуума на разные варианты для постановки эксперимента.

При полумикрометоде берут 1 мл плазмы с лейкоцитами и смешивают с 6 мл среды, к которой прибавляют 1 мл человеческой сыворотки AB (IV). Остальные все продукты такие же, как при постановке культуры основным методом.

Микрометод. Микрометод особенно часто употребляется в тех случаях, когда нужно получитъ культуру лейкоцитов от новорожденных, маленьких детей или плодов. Кровь для микрометода набирают в туберкулиновый шприц, снабженный иглой с прямым срезом. Кожу на пальце прокалывают либо иглой Франка, либо иглой для венепункции. Набирают кровь в шприц, предварительно смоченный гепарином. Обычно удается получить от 0,1 до 0,5 мл крови. Кровь (цельная, вместе с эритроцитами) вводят в заранее приготовленные пенициллиновые флаконы со средой такого же состава, что и при полумикрометоде. Микрокультура тем успешнее, чем больше крови введено в культуру. Фитогемагглютинин добавляют к среде при полумикрометоде и микрометоде в тех же количествах, что и при основном методе. При постановке микрокультур обязательно следует добавлять антибиотики, так как кровь забирается из пальца. Микрокультуры следует инкубировать больше чем 3 суток. Обычно достаточно 4—5 суток. Колхицин вводится в тех же количествах, что и в культуры, поставленные обычным методом. Следует отметить, что при использовании среды Игла качество культур намного выше (больше клеток претерпевает трансформацию и выше митотический индекс). Весьма важным обстоятельством, влияющим на культуру, является качество фитогемагглютинина. Наиболее хорошие результаты получаются при использовании фитогемагглютинина английской фирмы Wellcome и американской фирмы Difco Р и М. Фракция Р обладает значительно меньшими митогенетическими свойствами, чем фракция М. Некоторые исследователи вместо фитогемагглютинина применяют экстракт из фасоли, который готовят ex tempore. Однако кустарно изготовленные препараты обладают значительно меньшей активностью и действие их непостоянно.

Какие факторы влияют на успешность постановки культуры и получение хороших препаратов? В первую очередь следует отметить качество питательных сред и сыворотки. В настоящее время среды, выпускаемые Институтом вирусных препаратов и Институтом полиомиелита и вирусных энцефалитов, полностью удовлетворяют требованиям, предъявляемым к культурам для цитогенетических исследований. Тем не менее при постановке культур всегда необходимо записывать серию среды, чтобы сопоставлять результаты, полученные на средах разных серий. Что касается фитогемагглютинина, то наиболее воспроизводимые результаты дает препарат фирмы Wellcome. Следует отметить, что от некоторых лиц не удается получить культур, однако при повторных посадках все-таки наблюдаются удовлетворительные результаты. В нашей лаборатории отмечено, что у лиц, больных гриппом, крайне редко удается получить культуры хорошего качества. В ряде случаев, если при повторных посадках от данного индивидуума не удается получить хороших культур, полезно отделить путем центрифугирования лейкоциты от собственной плазмы и заменить ее сывороткой AB (IV).