а) Половой хроматин

Впервые ядерные образования, специфичные для особей женского пола, обнаружили Barr и Bertram (1949) при исследовании интерфазных ядер нейронов на обычных гистологических препаратах мозга кошки. Эти образования имеют вид компактных, интенсивно красящихся глыбок хроматина, расположенных под оболочкой ядра. Такие же образования далее были найдены в интерфазных ядрах всех млекопитающих, в том числе и человека. Специфичные для женского пола образования были обнаружены также в интерфазных ядрах таких высокодифференцированных клеток, как полиморфноядерные лейкоциты («drumstick»), однако в литературе название «половой хроматин», «тельце полового хроматина», «тельце Барра» (Barr body, sex chromatin) утвердилось за крупными хроматиновыми глыбками, имеющими особую форму и расположение в ядре. Чаще всего половой хроматин определяют в эпителиальных и соединительнотканных клетках. 

Вскоре после открытия Barr и Bertram половой хроматин продолжал исследоваться в гистологических препаратах с использованием традиционных методов окраски. В 1955 г. было предложено изучать половой хроматин в эпителиальных клетках, полученных из соскоба слизистой оболочки рта. Sanderson (1961) применил традиционную цитогенетическую технику раздавливания клеток в ацет-орсеине, что позволило свести время приготовления препарата к нескольким минутам. Этот метод, с различными модификациями, является в настоящее время общепринятым.

Метод исследования полового хроматина по Сандерсону

При помощи шпателя или предметного стекла соскабливают клетки с молярной поверхности слизистой оболочки щек. Соскоб наносят на предметное стекло в виде мазка. Сразу же на мазок наносят каплю уксуснокислого ацет-орсеина. Уксусная кислота фиксирует клетки, а орсеин хорошо выявляет ядерные структуры, почти не окрашивая цитоплазму. Большим пальцем придавливают покровное стекло, благодаря чему клетки уплощаются. Препарат исследуют при большом увеличении на половой хроматин. По сообщению Sanderson (1960), таким методом можно за час изготовить до 250 препаратов. Дальнейшие модификации касались в основном способов приготовления мазка и окраски. В качестве окраски предложены карболфуксин (Culling, 1966), крезилвиолет, галлоцианин, окраска по Фельгену. Однако большинство исследователей предпочитает ацет-орсеин. В нашей лаборатории приняты следующие модификации этого метода.

Взятие материала и приготовление мазка. Перед взятием соскоба пациента просят обкусать зубами слизистую оболочку щек и прополоскать рот. В случае, если имеют дело с пациентом, не выполняющим инструкции, ему протирают рот марлевой салфеткой. Эти процедуры необходимы для того, чтобы удалить десквамирующиеся клетки, в которых половой хроматин не выявляется. При помощи специального шпателя с загнутым и слегка отточенным концом производят соскабливание эпителия слизистой оболочки. Беловатый налет круговыми движениями распределяют по поверхности чистого сухого предметного стекла, стараясь, чтобы клетки равномерно распределялись тонким слоем. Не давая мазку высохнуть, погружают стекло в метанол для фиксации. Достаточно фиксировать в течение 10—25 минут.

Окраска. На мазок наносят каплю ацет-орсеина, приготовленного на смеси уксусной и молочной кислот. Накрывают препарат покровным стеклом, предоставляя краске равномерно распределиться по мазку. Излишки краски удаляют фильтровальной бумагой. Клетки окрашиваются через несколько секунд.

Микроскопия. При малом увеличении микроскопа (объектив Х10 или Х20) находят скопления клеток и переводят объективы на иммерсионную систему. Просматривают поля зрения, отмечая клетки с половым хроматином. Половым хроматином считают самые крупные хроматиновые глыбки, имеющие форму треугольника, полулуния или местного утолщения ядерной оболочки. Большинство исследователей принимает за половой хроматин только те хроматиновые глыбки, которые, обладая характерной формой, занимают и характерное положение в ядре, а именно прилегающие к внутренней поверхности ядерной оболочки. Половой хроматин следует учитывать только в клетках с неповрежденным ядром, имеющим нежную, тонкую хроматиновую структуру. Препрофазные ядра из анализа исключаются, так как при их исследовании легко впасть в ошибку. Подсчет ведется таким же методом, какой принят при исследовании мазков крови, т. е. последовательно, по определенной системе, меняя поля зрения, условными обозначениями или в уме отмечают ядра с четко выраженным половым хроматином. Как правило, учет ведут на 100 клеток, однако в сомнительных случаях следует просматривать несколько сотен клеток.

Учитывать ядра с половым хроматином нужно только среди таких ядер, где он мог бы быть выявлен, т. е. среди круглых или овальных ядер с нежным хроматиновым рисунком. Исследователю, не имеющему еще достаточного опыта, можно рекомендовать придерживаться вначале самых строгих критериев при толковании микроскопических картин, толкуя все сомнительные случаи в пользу отсутствия полового хроматина. Это предохраняет от неоправданно завышенных цифр. При подсчете полового хроматина описанным методом у нормальных женщин обнаруживается от 20 до 80 ядер с половым хроматином на 100 исследованных клеток, у нормальных мужчин — соответственно от 0 до 5 ядер.

В отличие от оригинального метода Сандерсона описанный метод позволяет собрать материал (зафиксированные мазки) в любых условиях с тем, чтобы в удобное для исследователя время подвергнуть их окраске и микроскопии. В случае надобности можно временные препараты перевести в постоянные. Для этого оставляют мазки в краске на срок от нескольких часов до суток (в зависимости от качества краски), затем осторожно снимают покровное стекло, ополаскивают препарат в 10—20% уксусной кислоте, проводят через гистологическую проводку, заключают в бальзам. Неокрашенные фиксированные мазки могут храниться неограниченно долго.

Половой хроматин можно исследовать в клетках различных тканей.

Исследование полового хроматина в клетках волосяной луковицы

При помощи пинцета-депилятория или просто пальцами вырывают волос с волосяной луковицей. Погружают волосяную луковицу в каплю ацет-орсеина и придавливают покровным стеклом. Половой хроматин хорошо выявляется в клетках волосяного фолликула.

Исследование полового хроматина в клетках кожи

Moore, Graham и Barr в 1953 г. предложили определять половой хроматин в клетках кожи. Биопсийный материал подвергался самой обычной гистологической обработке и окраске. Однако этот метод был вытеснен более простым, быстрым и безболезненным определением полового хроматина в клетках соскоба слизистой оболочки рта. Тем не менее этот метод сохраняет свое значение в некоторых специальных случаях — при исследовании судьбы трансплантатов и при определении мозаицизма по половым хромосомам. Применение техники раздавливания в ацет-орсеине вместо обычной гистологической техники позволяет значительно ускорить этот анализ. При помощи стерильного лезвия безопасной бритвы или скальпеля после подкожного введения раствора новокаина срезают небольшой (около 1 мм²) участок эпидермиса без подлежащей дермы. Кусочек погружают в фиксатор Карнуа (3:1) на 20 минут. Затем кусочек переносят в каплю ацет-орсеина в часовом стекле и выдерживают в нем от 30 минут до 2 часов. Отмывают окрашенный кусочек от излишка краски и отщипывают препаровальной иглой маленький фрагмент, который помещают в каплю расплавленной глицерин-желатиновой смеси. Накрывают покровным стеклом и раздавливают кусочек. Давление лучше всего производить карандашом с резинкой на конце. При раздавливании покровное стекло следует придерживать большим пальцем, не допуская бокового смещения стекла. Дают застыть глицерин-желатиновой смеси и приступают к микроскопированию. Благодаря применению глицерин-желатиновой смеси достигается одновременное заключение препарата. В этой смеси препарат может сохраняться больше года.

Исследование полового хроматина других клеток и тканей

Eskelund (1956) сообщил об исследовании полового хроматина в эпителиальных клетках осддка мочи. Образец мочи подвергали центрифугированию, из осадка приготовляли мазок, который автор окрашивал карболфуксином. Имеются сообщения об исследовании полового хроматина в клетках спинномозговой жидкости. Интересный метод был предложен для ранней пренатальной диагностики пола эмбриона. При помощи пункции плодного пузыря брали амниотическую жидкость и определяли половой хроматин в ее клетках. Необходимость такого исследования, несмотря на его небезопасность, диктуется, по мнению авторов, в тех случаях, когда требуется определить пол будущего ребенка у женщины — кондуктора какого-либо тяжелого заболевания, сцепленного с полом. В частности, подобное исследование авторы предприняли у женщины, отец которой страдал гемофилией.

Много работ посвящено исследованию полового хроматина в опухолях. При этом авторы пользовались обычной гистологической техникой. Н. П. Бочков, М. М. Антощина и Н. С. Стонова (1966) сообщили о результатах исследования полового хроматина в клетках почечных канальцев мертворожденных детей. Интерес этой работы состоит не только в полученных результатах, но и в том, что авторы продемонстрировали возможность исследования полового хроматина в посмертном материале при просмотре препаратов из архива патологоанатомических отделений. С. И. Любинская (1966) сообщила о возможности определения полового хроматина в судебно-медицинских целях в эпителиальных клетках слизистой оболочки рта, извлеченных из окурков.

б) Исследование полиморфноядерных нейтрофилов

Davidson и Robertson Smith в 1954 г. обнаружили, что сегментированные ядра полиморфноядерных лейкоцитов имеют характерные образования, некоторые из них встречаются преимущественно у женщин. В обычных гематологических препаратах, окрашенных по Романовскому—Гимзе или Май — Грюнвальду, на одной из долей сегментоядерного лейкоцита выявляются своеобразные образования, названные «drumstick» (барабанные палочки), «sessile nodules» («сидячие узелки») и «small club» (маленькие булавы). Kosenow (1956) и после статистической обработки показал, что некоторые из этих образований («drumsticke» — барабанные палочки) типичны для женщин, другие встречаются и у мужчин. Количество нейтрофилов с барабанными палочками значительно варьирует у разных индивидуумов женского пола (0,6—8,8% по Kosenow, 1956).

Значение метода определения полового хроматина

Метод определения полового хроматина позволяет быстро получить ориентировочные данные о системе половых хромосом. Он позволяет одномоментно подвергнуть обследованию большие популяции. Этот метод является единственным позволяющим судить о половой принадлежности посмертно полученного материала. Однако следует подчеркнуть, что при всех его достоинствах метод определения полового хроматина является ориентировочным и всегда, когда это возможно, требует подтверждения или уточнения анализом хромосом.