Радиоавтография основана на использовании химических соединений меченных радиоактивными изотопами и способных включаться в компоненты клетки в ходе нормального метаболизма. При радиоавтографическом исследовании хромосом используется дезоксирибозид тимина — тимидин, меченный тритием (Н3). В цитогенетике используются и другие меченые соединения для изучения других компонентов хромосомы — белка и рибонуклеиновой кислоты.
Однако использование тимидина, меченного тритием, является основным. Тимидин включается в состав клеточной ДНК при помощи фермента тимидинкиназы. Тритий Н3 испускает только B-лучи, которые в водной среде вызывают эмиссию электронов на расстоянии максимум Зц. В фотографической эмульсии действие B-излучения распространяется в диаметре Зц. Период полураспада трития равен 12,3 года со скоростью распада 0,016 % ежедневно.
Тимидин может включаться в хромосомы лишь в определенный период клеточного цикла, а именно в фазе синтеза ДНК (S-фаза). Именно поэтому при радиоавтографических исследованиях необходимо точное знание клеточного цикла исследуемого объекта. У большинства типов клеток млекопитающих и человека, используемых в цитогенетических исследованиях, клеточный, или митотический, цикл занимает 24—30 часов. Продолжительность периода S довольно значительно колеблется в зависимости от типа клеток или культур. Согласно Bender и Prescott (1962), в лейкоцитах периферической крови, культивируемых in vitro, продолжительность периода синтеза равняется 12 часам. Продолжительность митотического цикла и отдельных его фаз также изучается при помощи меченого тимидина. Методы определения митотического цикла с помощью тимидина-Н3 в культуре клеток человека описаны в работах А. И. Зосимовской и Н. А. Ляпуновой (1966).
При помощи радиоактивной метки можно определить время репродукции тех или иных хромосом и отдельных участков хромосом, т. е. составить представление о временной характеристике процесса репликации ДНК. Для этой цели используют так называемое импульсное включение изотопа. При этом меченое соединение вводят в культуру на короткое время (около 10 минут), после чего клетки продолжают расти в среде бел меченого соединения. Фиксируя клетки в различное время после введения метки, можно получить картину распределения метки в различных хромосомах и их отдельных участках. Известно, что у женщин одна из Х-хромосом инактивирована и реплицируется в конце периода синтеза. Для обнаружения такой поздно реплицирующейся хромосомы (что может оказаться необходимым в ряде спорных случаев) используют длительное включение изотопа продолжительностью до 3 часов. При этом меченый тимидин вводят в культуру за 3 часа до фиксации. При таких условиях меченый тимидин включится только в Х-хромосому.
Особенности включения меченого тимидина в различные хромосомы важны для решения проблемы идентификации хромосом.
Основные процедуры радиоавтографического исследования
1. Культура клеток: используется культура лимфоцитов периферической крови или культура эмбриональных фибробластов в логарифмической стадии роста.
2. Меченое соединение: используется тимидин, меченный тритием с удельной активностью 3 кюри на 1 мМ. Обычно используется концентрация меченого тимидина в пределах от 1 до 2 мк на 1 мл.
3. Продолжительность контакта клеток с меченым соединением зависит от цели исследования. При импульсной метке тимидин-Н3 вводят на 10—15 минут, при длительной метке — на 2—6 часов. Культуры эмбриональных фибробластов, растущие на стекле, более удобны, так как можно извлечь покровные стекла с растущими на них клетками и погрузить их в специальный сосуд с небольшим количеством радиоактивной среды (С. И. Слезингер, А. А. Прокофьева-Бельговская, 1966). При работе с культурой лейкоцитов приходится прибегать к центрифугированию клеток.
4. Сбор клеток, гипотоническая обработка и фиксация проводятся так же, как и для получения препаратов метафазных хромосом.
5. Стекла (предметные, если производилась фиксация клеток в суспензии, или покровные, если использовалась культура, растущая на стекле) покрывают ядерной эмульсией типа М (НИКОИ), предварительно разогретой до 37°. Эта процедура проводится в фотокомнате со всеми предосторожностями, необходимыми при работе с фотоматериалами.
6. Покрытые эмульсией стекла экспонируют в темном ящике при комнатной температуре. Продолжительность экспонирования до 3 недель. После этого эмульсию проявляют амидоловым проявителем НИКФИ и закрепляют кислым фиксажем.
7. Препараты окрашивают сквозь эмульсию голубым по Унна и просматривают под микроскопом. Метафазы, пригодные для анализа, фотографируют.
8. После фотографирования метку удаляют путем обработки радиоавтографов насыщенным раствором железосинеродистого калия и тиосульфата натрия. После удаления метки препараты можно докрасить более интенсивно; их фотографируют для точной идентификации. Фотографируют те же іметафаізы, т. е. с меткой.
9. Хромосомы расклеивают по денверской системе так, чтобы были представлены хромосомы одной и той же метафазной пластинки с меткой и без нее. На фотографиях подсчитывают число гранул серебра над каждой хромосомой и над отдельными участками хромосом.
Некоторые исследователи предпочитают сначала окрашивать препарат обычным методом (однако не заключая его в бальзам). После фотографирования подходящих клеток краску удаляют (спиртом), препарат покрывают эмульсией и проявляют.
При исследовании метки в культурах фибробластов, растущих на покровных стеклах, последние приклеивают к предметному стеклу клетками вверх канадским бальзамом.
Более подробные методические указания даны в работах А. И. Зосимовской и Н. А. Ляпуновой (1966), С. И. Слезингера и А. А. Прокофьевой- Бельговской (1965, 1966), А. Ф. Захарова (1966), Shmid (1966).